Improvement of the quality of insect-cell-derived, recombinant pro-VEGF-C

Abstract

The aim of this thesis work was to improve the quality of recombinant pro-VEGF-C produced by insect cells. High-quality pro-VEGF-C is needed for biomedical research and has been so far only available in limited amounts from mammalian expression systems. VEGF-C is a signaling molecule essential for the growth of lymphatic vessels. It plays important roles in many diseases and, therefore, many drugs are being developed, which target VEGF-C.

An existing insect cell expression vector was modified by adding antibiotic resistance genes for Ampicillin and Hygromycin B via restriction enzyme cloning, resulting in the novel vector pIZ-HygroA. cDNAs of calreticulin, CDC37, PH4B, PDIA3 and cyclophilin B were amplified by PCR and cloned into pIZ-HygroA via a TOPO intermediate. These proteins were chosen based on their presumed ability to assist in the folding of VEGF-C. Expression vectors were transfected into VEGF-C-expressing insect cells. The expression of helper proteins and VEGF-C expression levels and quality were analyzed by Western blotting and a bioassay, which measures VEGF-C activity.

The analysis was completed for calreticulin and cyclophilin B. The Western blots showed no difference in the ratio of covalently to noncovalently linked VEGF-C dimers. However, the process of hygromycin selection seemed to lower the VEGF-C expression levels of the insect cells. The results from the Ba/F3-VEGFR-3/EpoR assay indicated that cycophilin B might have a modest effect on the quality of VEGF-C, while calreticulin had no effect. Further analysis is still needed to confirm the results and to complete the analysis for CDC37, PH4B and PDIA3.

Tämän insinöörityön tarkoituksena oli parantaa hyönteissolujen tuottaman, rekombinantti pro-VEGF-C:n laatua. Korkealaatuista pro-VEGF-C:tä tarvitaan biolääketieteellisessä tutkimuksessa ja toistaiseksi sitä on saatavana vain rajallisissa määrin nisäkässolujen tuottamana. VEGF-C on viestimolekyyli, joka on välttämätön imusuoniston kasvulle. Sillä on myös keskeinen rooli monien sairauksien muodostumisessa ja siksi VEGF-C:n toimintaan kohdistettuja lääkkeitä kehitetään jatkuvasti.

Työ aloitettiin lisäämällä valmiiseen hyönteisekspressiovektoriin ampisilliini ja hygromysiini antibioottiresistenssigeenit yhdistelmä-DNA-tekniikalla, ja näin saatiin aikaan uusi vektori, pIZ-HygroA. PCR:llä monistettujen proteiinien calreticulinin, CDC37:n, PH4B:n, PDIA3:n ja syklofiliini B:n cDNA:t kloonattiin ensin TOPO vektoriin, jonka kautta uuteen pIZ-HygroA vektoriin. Nämä kyseiset proteiinit valittiin siksi, että niillä on ominaisuuksia, joiden oletetaan auttavan VEGF-C:n laskostumisessa. Uudet ekspressiovektorit transfektoitiin VEGF-C:tä tuottaviin hyönteissoluihin, joissa yllämainittujen auttajaproteiinien, sekä VEGF-C:n ilmentämistä ja laatua analysoitiin Western blot -menetelmällä, sekä bioanalyysillä, jolla mitataan VEGF-C:n aktiivisuutta.

Tutkimus saatiin suoritettua calreticulinin ja cyclophilin B:n osalta. Western blot -tulosten perusteella ei nähty eroa kovalenttisesti ja ei-kovalenttisesti sitoutuneiden VEGF-C dimeerien suhteessa ja hygromycin selektio näytti vaikuttavan alentavasti hyönteisolujen VEGF-C:n ekspressiotasoon. Ba/F3-VEGFR-3/EpoR-analyysissä kuitenkin nähtiin, että cyclophilin B:llä oli lievä vaikutus VEGF-C:n laatuun. Calreticulinilla vaikutusta ei havaittu. Tulosten varmistamiseksi, sekä tutkimuksen suorittamiseksi myös CDC37:llä, PH4B:lla ja PDIA3:lla tarvitaan kuitenkin vielä lisää tutkimuksia.