NAV3-geenimerkkiainemenetelmän kehittämisprojekti

Abstract

Syöpä on hyvin yleinen geneettinen sairaus, johon sairastuu noin joka kolmas suomalainen elinikänsä aikana. NAV3-geeni on syöpään yhdistetty merkkiainegeeni, joka sijaitsee kromosomissa 12. Geenin toistojaksomutaatioita on löydetty lukuisista eri syöpätyypeistä ja mutaation laadulla on todettu olevan yhteys myös tiettyjen syöpien ennusteeseen. Toistojaksomutaatioita voidaan tutkia soluista fluoresenssi in situ hybridisaatiolla, jossa tutkittavalle geenille komplementaariset fluoresoivalla merkkiaineella leimatut koettimet sitoutuvat näytteeseen eri tavalla riippuen kromosomissa olevien toistojaksojen määrästä. Sitoutuneen koettimen lähettämä fluoresenssisignaali voidaan havaita fluoresenssimikroskoopilla.

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää NAV3-geenimerkkiainemenetelmää ValiFinnin ja Oulun ammattikorkeakoulun laboratoriotiloissa siten, että menetelmästä saataisiin kyseisissä tiloissa toimiva ja laadukas kokonaisuus, jota voidaan käyttää laboratoriossa rutiinisti. Menetelmä testattiin toistamalla se ohjeiden mukaan useaan kertaan. Koettimien toimivuus tarkistettiin lopuksi fluoresenssimikroskoopilla. Menetelmätyöohjeet olivat valmiiksi standardoidut, mutta niitä jouduttiin muokkaamaan uusiin tiloihin ja laitteistoihin sopiviksi. Menetelmiin kuului laitteiston, näytteiden ja reagenssien kartoitus ja tilaaminen, liuosten valmistaminen, bakteerien kasvattaminen, DNA:n eristäminen, alukkeiden suunnittelu ja tilaaminen, koettimien ja näytemateriaalin valmistus, fluoresenssi in situ hybridisaatio ja hybridisaation analysointi fluoresenssimikroskoopilla.

Näytteet ja liuokset saatiin valmistettua menetelmätyöohjeiden mukaisesti, mutta itse fluoresenssi in situ hybridisaatio saatiin toimimaan vain osittain. Hybridisaatio ei ollut tarpeeksi spesifi ja sitoutuneista koettimista saadut signaalit olivat suhteellisen heikkoja. Tulokset olivat kuitenkin lupaavia, sillä koettimia optimoimalla hybridisaatio saadaan todennäköisesti jatkossa toimimaan. Kehitystyötä voidaan jatkaa esimerkiksi tehostamalla DNA-eristystä sekä muuntelemalla koettimien teko-olosuhteita.

Cancer is a very common genetic disease and one in three Finn will get the disease during their lifetime. NAV3-gene is a new marker gene located in chromosome 12 associated with cancer. NAV3 copy number variations have been associated with multiple different cancer types and quality of the mutation has also been linked with the prognosis of the disease. Copy number variations can be detected using fluorescence in situ hybridization which is based on complementary fluorescent probes that bind to the sample differently depending on the copy number variation. The fluorescence signal from the probe can be detected using a fluorescence microscope.

Purpose of this thesis was to develop the NAV3 marker gene method in Valifinn and OAMK laboratory facilities to gain a functional and good quality method that can be used routinely in the laboratory. The method was tested by repeating it multiple times. The probes were tested in the end using a fluorescence microscope. The laboratory procedure manuals were standardized but they were slightly altered to fit the equipment and laboratory facilities we used. The method included survey and ordering of laboratory equipment, reagents and samples, growing bacteria, isolating DNA, planning and ordering primers, preparing probes and samples, fluorescence in situ hybridization and analyzing the samples.

The samples and solutions were prepared successfully according to the laboratory procedure manuals but the fluorescence in situ hybridization was only partially successful. The hybridization was not specific enough and the fluorescence signal seen in the fluorescence microscope was relatively weak. However the results were promising and it's likely that the method will be successfully optimized in the near future. The development work can be continued by enhancing the DNA-isolation and altering the procedure conditions while preparing the fluorescence probes.