UPLC-menetelmän kehitys : CYP17A1-entsyymin reaktiotuotteiden määritys

Abstract

Steroidihormonit ovat syklisiä orgaanisia yhdisteitä ja niihin kuuluu mm. sukupuolihormonit ja lisämunuaiskuoren hormonit. Steroidihormonien lähtöaineena on kolesteroli, joka muuntuu useiden entsyymien katalysoimien reaktioiden kautta muiksi steroidihormoneiksi. Biosynteesipolun alkuvaiheen reaktiota katalysoi CYP17A1-entsyymi.

Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää UPLC-menetelmä CYP17A1-entsyymin katalysoimien reaktioiden tuotteille, joita analysoidaan radioleimattuna radiodetektorilla. Menetelmäkehitys tehtiin kuitenkin diodirividetektorilla, sillä kaikkia reaktiotuotteita ei ollut saatavilla radioleimattuna.

Menetelmäkehitys aloitettiin kirjallisuushaussa etsityn menetelmän pohjalta ja kehityksen aikana testattiin erilaisia kolonneja, gradientteja, sekä ajoajan muuttamista. Menetelmäkehityksestä saatua menetelmää käytettiin radiodetektorin parametrien optimointiin. Parametrien optimointi vaikutti radiodetektorilla saatuihin kromatogrammeihin, minkä takia se oli tärkeä vaihe menetelmäkehityksessä. Menetelmän toistettavuutta testattiin radioleimatuilla näytteillä, sekä sen suorituskykyä HCT116-CYP17A1-solunäytteillä.

Opinnäytetyölle asetettuihin tavoitteisiin päästiin, sillä menetelmällä saatiin CYP17A1-reaktioiden tuotteet erottumaan toisistaan ja määritettyä niiden väliset suhteelliset osuudet.

Steroid hormones are cyclic organic compounds that include sex hormones and adrenal hormones. The biosynthesis of steroid hormones starts from cholesterol, and through a series of enzyme-catalyzed reactions, the cholesterol is converted to other steroid hormones. The CYP17A1 enzyme catalyzes multiple reactions at the start of the biosynthesis pathway.

The aim of the thesis was to develop an UPLC method for the radiolabeled products of reactions catalyzed by the CYP17A1 enzyme, the products being analyzed by a radio detector. However, the method development was performed with a diode array detector, as not all reaction products were available as radiolabeled products.

The method development started with a method found in the literature, followed by testing of different columns, gradients, and run time. The developed method was used to optimize the parameters of the radio detector. The optimization of the parameters was a key step as they affected the obtained chromatograms. The method was tested for repeatability with radiolabeled samples and for performance with HCT116 CYP17A1 cell samples.

The thesis objectives were achieved as the method was able to separate the products of the CYP17A1 reactions and determine their relative proportions.