Fragment Analyzer -mikrobiyhteisöanalyysimenetelmän soveltuvuus teollisuuden prosessiolosuhteiden seurantaan
Bui, Andy (2022)
Bui, Andy
2022
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2022112824569
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2022112824569
Tiivistelmä
Opinnäytetyö suoritettiin Kemira Oyj:n Espoo R&D and Technologies -toimipisteessä Mikrobiologian ja Bioteknologian osastolla osana Metropolian Ammattikorkeakoulun laboratorioanalyytikon koulutusta. Tavoitteena oli selvittää, kuinka hyvin Fragment Analyzer -laite soveltuu mikrobiyhteisön seurantaan teollisuuden prosessiolosuhteissa. Menetelmä olisi nopeampi ja kustannustehokkaampi verrattuna sekvensointiin.
Projektissa valitut DNA-näytteet monistettiin PCR:llä ja analysoitiin Fragment Analyzer -laitteella. DNA-näytteitä oli 50. Monistettava geeni näytteissä oli 16S-rRNA:n V1–V2-hypervariaabelialue. Kyseinen geeni on kaikissa bakteereissa, ja menetelmä perustuu geenissä esiintyviin emäsparipituuden vaihteluihin eri bakteerien välillä. Fragment Analyzer -laite tunnistaa nämä erikokoiset monistustuotteet ja luo sormenjäljen, niin sanotun piikkiprofiilin. Näitä piikkiprofiileja analysoimalla ja seuraamalla voidaan määrittää, onko bakteeriyhteisö pysynyt samana tai onko se muuttunut. Menetelmä on siis yhteisösormenjälkimenetelmä, tarkemmin Length Heterogeneity PCR (LH-PCR).
Tuloksien perusteella todettiin, että menetelmä soveltuu yksinkertaisten mikrobiyhteisöjen seurantaan. Piikkiprofiileista voidaan tunnistaa vallitsevia bakteereita sekvenssitietojen sekä edellisten tulosten avulla. Menetelmää ei suositella sellaisenaan laajempaan käyttöön, tai määrittämään kvantitatiivisesti bakteerien osuuksia mikrobiyhteisössä. Tuloksista saatuja osuuksia voidaan kuitenkin katsoa suuntaa antavana.
Pääongelmana on monistetun geenin pieni osuus PCR-tuotteissa, mikä näkyy tuloksia tarkastellessa. Menetelmän parantamiseksi suositellaan tutkimaan, jos eri alukkeet toimisivat paremmin, PCR-reaktioseoksen säätöä, mahdollisesti PCR-ajo-ohjelman optimoimista, jotta saataisiin monistetun DNA:n osuus korkeammaksi. Juuri nyt vallitseva osuus PCR-tuotteesta on alukedimeereitä. Näytteistä suositellaan myös tekemään rinnakkaisnäytteet, mutta sen tarpeellisuus voi muuttua, jos menetelmää saadaan parannettua luotettavammaksi.
Projektissa valitut DNA-näytteet monistettiin PCR:llä ja analysoitiin Fragment Analyzer -laitteella. DNA-näytteitä oli 50. Monistettava geeni näytteissä oli 16S-rRNA:n V1–V2-hypervariaabelialue. Kyseinen geeni on kaikissa bakteereissa, ja menetelmä perustuu geenissä esiintyviin emäsparipituuden vaihteluihin eri bakteerien välillä. Fragment Analyzer -laite tunnistaa nämä erikokoiset monistustuotteet ja luo sormenjäljen, niin sanotun piikkiprofiilin. Näitä piikkiprofiileja analysoimalla ja seuraamalla voidaan määrittää, onko bakteeriyhteisö pysynyt samana tai onko se muuttunut. Menetelmä on siis yhteisösormenjälkimenetelmä, tarkemmin Length Heterogeneity PCR (LH-PCR).
Tuloksien perusteella todettiin, että menetelmä soveltuu yksinkertaisten mikrobiyhteisöjen seurantaan. Piikkiprofiileista voidaan tunnistaa vallitsevia bakteereita sekvenssitietojen sekä edellisten tulosten avulla. Menetelmää ei suositella sellaisenaan laajempaan käyttöön, tai määrittämään kvantitatiivisesti bakteerien osuuksia mikrobiyhteisössä. Tuloksista saatuja osuuksia voidaan kuitenkin katsoa suuntaa antavana.
Pääongelmana on monistetun geenin pieni osuus PCR-tuotteissa, mikä näkyy tuloksia tarkastellessa. Menetelmän parantamiseksi suositellaan tutkimaan, jos eri alukkeet toimisivat paremmin, PCR-reaktioseoksen säätöä, mahdollisesti PCR-ajo-ohjelman optimoimista, jotta saataisiin monistetun DNA:n osuus korkeammaksi. Juuri nyt vallitseva osuus PCR-tuotteesta on alukedimeereitä. Näytteistä suositellaan myös tekemään rinnakkaisnäytteet, mutta sen tarpeellisuus voi muuttua, jos menetelmää saadaan parannettua luotettavammaksi.