CRISPR-Cas9-genomieditointipalvelun käyttöönoton edistäminen
Liimatta, Roni (2022)
Liimatta, Roni
2022
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202203073153
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202203073153
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston genomibiologian keskuspalveluyksikölle. Genomibiologian yksikkö eli GBU (Genome Biology Unit) tarjoaa erilaisia genomin laajuisten kloonikirjastojen jakelu- ja modifiointipalveluita Helsingin yliopiston ja muiden Biocenter Finland -yliopistojen tutkimusryhmien käyttöön. Tämän opinnäytetyön tarkoitus oli edistää GBU:n CRISPR-Cas9-menetelmään pohjaavan uuden genomieditointipalvelun käyttöönottoa.
Työ aloitettiin suunnittelemalla gRNA-Cas9-kompleksiin tarvittavat Opas-RNA:t eli gRNA:t tutkimusryhmän intresseissä oleville geeneille (STK11, STING1, ULK1, Ezh2, Met, Hgf, Il11, Axl ja Nrg1) Benchling-sovellusalustalla. gRNA:n sekvenssi vastaa modifioinnin kohdetta, ja sitä muokkaamalla pystytään vaikuttamaan siihen, mihin kohtaan genomissa gRNA-Cas9-kompleksi sitoutuu. Kohteeseen sitoutumisen jälkeen Cas9-proteiini katkaisee nukleaasidomainien avulla kaksijuosteisen DNA:n ja lopputuloksena syntyy kaksoisjuosteen katkos eli DSB (double-strand break). Tässä työssä gRNA:t suunniteltiin siten, että DSB syntyisi geenissä sellaiseen kohtaan, joka aiheuttaisi geenin inaktivaation. Tämän avulla voidaan tutkia geenin toimintaa.
Opas-RNA:n (gRNA1) ylä- ja alajuoksuun suunniteltiin etu- ja taka-alukkeet 150 ja 500 emäsparin päähän, näiden tarkoituksena on monistaa polymeraasiketjureaktion avulla (PCR) genomieditoinnin kohteena oleva alue geenistä. Sekvensoimalla kyseinen alue editoiduista soluista voidaan selvittää, onko genomieditointi onnistunut. Työn yhtenä tavoitteena oli määrittää, toimiiko sekvensointimenetelmä editoinnin varmistamisessa, ja voidaanko sitä täten tarjota palveluna. Etu- ja taka-alukkeiden sekä gRNA:n suunnittelulle luotiin uusi protokolla GBU:lle.
Työn seuraavassa vaiheessa kaikille geeneille suunnitellut gRNA:t kloonattiin lentivirusvektoriin (lentiCRISPRv2 Puro). Konstruktin valmistamiselle laskettiin tarvikkeiden kulutuksen ja ajankäytön kautta kustannusarvio, joka tulee määrittämään tarjottavan palvelun hinnan. Seuraavassa vaiheessa vektorit tullaan siirrostamaan lentivirukseen, millä infektoidaan soluja. Jos menetelmä toimii odotetulla tavalla, niin lentivirus siirtää gRNA-Cas9 kompleksia koodaavan DNA:n haluttuun solulinjaan, jonka genomin haluttuun kohtaan muodostuu kaksoisjuosteen katkos.
Työ aloitettiin suunnittelemalla gRNA-Cas9-kompleksiin tarvittavat Opas-RNA:t eli gRNA:t tutkimusryhmän intresseissä oleville geeneille (STK11, STING1, ULK1, Ezh2, Met, Hgf, Il11, Axl ja Nrg1) Benchling-sovellusalustalla. gRNA:n sekvenssi vastaa modifioinnin kohdetta, ja sitä muokkaamalla pystytään vaikuttamaan siihen, mihin kohtaan genomissa gRNA-Cas9-kompleksi sitoutuu. Kohteeseen sitoutumisen jälkeen Cas9-proteiini katkaisee nukleaasidomainien avulla kaksijuosteisen DNA:n ja lopputuloksena syntyy kaksoisjuosteen katkos eli DSB (double-strand break). Tässä työssä gRNA:t suunniteltiin siten, että DSB syntyisi geenissä sellaiseen kohtaan, joka aiheuttaisi geenin inaktivaation. Tämän avulla voidaan tutkia geenin toimintaa.
Opas-RNA:n (gRNA1) ylä- ja alajuoksuun suunniteltiin etu- ja taka-alukkeet 150 ja 500 emäsparin päähän, näiden tarkoituksena on monistaa polymeraasiketjureaktion avulla (PCR) genomieditoinnin kohteena oleva alue geenistä. Sekvensoimalla kyseinen alue editoiduista soluista voidaan selvittää, onko genomieditointi onnistunut. Työn yhtenä tavoitteena oli määrittää, toimiiko sekvensointimenetelmä editoinnin varmistamisessa, ja voidaanko sitä täten tarjota palveluna. Etu- ja taka-alukkeiden sekä gRNA:n suunnittelulle luotiin uusi protokolla GBU:lle.
Työn seuraavassa vaiheessa kaikille geeneille suunnitellut gRNA:t kloonattiin lentivirusvektoriin (lentiCRISPRv2 Puro). Konstruktin valmistamiselle laskettiin tarvikkeiden kulutuksen ja ajankäytön kautta kustannusarvio, joka tulee määrittämään tarjottavan palvelun hinnan. Seuraavassa vaiheessa vektorit tullaan siirrostamaan lentivirukseen, millä infektoidaan soluja. Jos menetelmä toimii odotetulla tavalla, niin lentivirus siirtää gRNA-Cas9 kompleksia koodaavan DNA:n haluttuun solulinjaan, jonka genomin haluttuun kohtaan muodostuu kaksoisjuosteen katkos.