hARO-Luc -hiirimalli : lusiferaasiaktiivisuuden mittaaminen hiiren kudoksista

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Turun ylipiston biolääketieteen laitoksella ja se oli osa laajempaa Fubio-projektia. Opinnäytetyön tarkoituksena oli testata uutta Turun yliopistossa tuotettua ihmisen aromataasigeenin koko säätelyaluetta ilmentävää hiirimallia ja tutkia, kuinka hyvin aromataasigeenin säätely hiirimallissa kuvastaa aromataasin säätelyä naisilla, etenkin rasvakudoksissa.

Työssä käytettiin FVB/N -hiirikantaan tuotettua hARO-Luc -siirtogeenihiirimallia, joka ilmentää ihmisen aromataasigeenin koko eksoni 1 -promoottorialueita (eksonit 1-10) yhdistettynä lusiferaasireportterigeeniin. Siinä haluttiin tutkia, miten hyvin tuotettu hiirimalli kuvastaa tilannetta ihmisessä. Tutkimuksessa käytettiin kahta hiirityyppiä OVX ja SHAM. OVX-hiirille on tehty toimenpide, jossa niiden munasarjat on poistettu ja SHAM-hiireille on tehty sama toimenpide ilman itse koetoimenpidettä, jotta molemmat hiirityypit kokevat saman stressin. SHAM -hiiret edustavat premenopausaalista tilannetta ja OVX-hiiret postmenopausaalista tilannetta. Työssä määritettiin näytteiden lusiferaasiaktiivisuus, joka suhteutettiin näytteiden proteiinipitoisuuteen.

Jatkotutkimuksessa haluttiin tutkia, vaikuttaako plasebopelletin lisäysoperaatio reportterin lusiferaasi-ilmentymiseen maitorauhasessa ja onko eri maitorauhasten välillä eroja. Plasebo on näennäislääke eli aine, jolla ei ole aineellista vaikutustapaa, mutta se toimii lääkkeen tavoin, koska tutkittava kohde uskoo sen lääkkeeksi. Lisäksi haluttiin tutkia, vaikuttaako hiirten ikä reportterin ilmentymiseen rasvakudoksessa.

Tuloksissa ainoa rasvakudos, jolla oli merkittäviä eroja hiirten välillä, oli maitorauhanen. Muissa kudoksissa ei ollut merkittäviä eroja. Jatkotutkimuksessa osoitettiin, että pelkkä pelletin lisäysoperaatio nostaa maitorauhasen lusiferaasin ilmentymistä huimasti, joten tämä menetelmä ei sellaisenaan sovellu maitorauhasessa paikallisesti aromataasia säätelevien tekijöiden tutkimiseen. Myöskään eri-ikäisten hiirten ja eri maitorauhasten välillä ei ollut merkittäviä eroja.

This thesis was conducted at the Institute of Biomedicine of Turku University as part of the Fubio project. The purpose of this thesis was to investigate how well the mouse model expres¬sing the human aromatase gene promoter reflects the examined situation in humans, especially in different adipose tissues.

In this study FVB/N based transgenic mice, hARO-Luc were used, which express the full-length human aromatase gene promoter region connected to the luciferase reporter. Two types of mice were used, SHAM and OVX. The SHAM mice had undergone same operation as the OVX without removal of ovaries so that they would experience the same stress. The SHAM mice represented the situation in premenopausal women while OVX mice represented the postmenopausal situation. A luciferase Assay Kit was used for measuring the luciferase activity and a BCA2 Assay Kit was used for determining the protein, by which the lusiferase activities in dif¬ferent size of tissues were balanced.

A further purpose of the study was to determine how the placebo pellet insertion procedure affects the luciferase expression of the reporter and whether there are differences between different mammary glands. The placebo pellet is a simulated or otherwise medically ineffectual solution that works as a medicine because the target believes it as a drug. The study also set out to determine whether the age of mice affects the luciferase expression in adipose tissues.

In the results of the study, the only adipose tissue that showed differences between SHAM and OVX mice was mammary gland. There were no statistical differences in any other tissues. Furt¬her investigation showed that the insertion of pellet increases the luciferase expression significantly. Consequently this method was not suitable for investigating the effects of PGE2, it being known that the PGE2 affects the aromatase expression in mammary glands. Neither were there significant differences between mice of different ages or between different mammary glands.