Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-menetelmän pystyttäminen patogeenisten A-ryhmän streptokokkien osoitusdiagnostiikkaa varten
Hyvönen, Suvi (2013)
Hyvönen, Suvi
Turun ammattikorkeakoulu
2013
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201304265306
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201304265306
Tiivistelmä
Streptococcus pyogenes -bakteerin eri kannoista käytetään yhteisnimitystä A-ryhmän streptokokit. A-ryhmän streptokokit aiheuttavat ihmiselle immuunipuolustuksen heiketessä infektiosairauksia, joista yleisin on nielurisatuledus. Hoitamattomana Streptokokki A voi aiheuttaa vakavan yleisinfektion, joka pahimmillaan voi johtaa potilaan kuolemaan. Tämän vuoksi bakteerin nopea ja luotettava diagnosointi on tärkeää. Tämä on kuitenkin haastavaa, sillä Streptococcus pyogeneksesta tunnetaan satoja eri kantoja, joilla kaikilla on erilaiset geenisekvenssit. Lisäksi myös jotkin S. pyogeneksen kanssa lähisukuiset bakteerit, kuten Streptococcus dysgalactiae subs. equisimilis ilmentävät A-ryhmän streptokokkien diagnosointiin perinteisesti käytettyä Lancefieldin A-ryhmän antigeeniä.
Tutkimus toteutettiin ArcDia International Oy Ltd:n toimeksiantona. Tutkimuksen tarkoituksena oli pystyttää reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-menetelmä, joka olisi vähintään yhtä herkkä kuin yhtiön kehittämä mariPOC®-pikatestimenetelmä. Testeillä saatuja tuloksia voitaisiin tällöin verrata keskenään, ja varmentaa mariPOC®:illa saatuja matalia positiivisia testituloksia. Työn tavoitteena oli testata Molekyylidiagnostiikan laboratorion testeissä aiemmin optimoituja alukkeita ja lyhyttä UPL-hydrolyysikoetinta ja tutkia eri sterptokokkilajien puhdasviljelmänäytteiden sekä kliinisten potilasnäytteiden reagoimista qPCR-testissä.
Tutkimuksessa päästiin vaiheeseen, jossa testillä voitiin todeta positiivisiksi näytteet, joiden kohdebakteeripitoisuus 357 bakteeria näytekuopassa (10 µl). MariPOC®:in tarkkuus puolestaan on 500 CFU millilitrassa. Testeissä Streptococcus mitis reagoi tuottaen väärän positiivisen tuloksen, joten testiin valittu koetin ei ollut riittävän spesifinen. Seuraavat vaiheet testin kehittämisessä ovat pidemmän ja spesifisemmän koettimen, positiivisen kontrollitemplaatin (kohde-DNA:n kvantitatointi standardisuoralta) sekä sisäisen kontrollitemplaatin (testin toiminnan ja negatiivisten tulosten varmentaminen) suunnittelu ja testaaminen.
Tutkimus toteutettiin ArcDia International Oy Ltd:n toimeksiantona. Tutkimuksen tarkoituksena oli pystyttää reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-menetelmä, joka olisi vähintään yhtä herkkä kuin yhtiön kehittämä mariPOC®-pikatestimenetelmä. Testeillä saatuja tuloksia voitaisiin tällöin verrata keskenään, ja varmentaa mariPOC®:illa saatuja matalia positiivisia testituloksia. Työn tavoitteena oli testata Molekyylidiagnostiikan laboratorion testeissä aiemmin optimoituja alukkeita ja lyhyttä UPL-hydrolyysikoetinta ja tutkia eri sterptokokkilajien puhdasviljelmänäytteiden sekä kliinisten potilasnäytteiden reagoimista qPCR-testissä.
Tutkimuksessa päästiin vaiheeseen, jossa testillä voitiin todeta positiivisiksi näytteet, joiden kohdebakteeripitoisuus 357 bakteeria näytekuopassa (10 µl). MariPOC®:in tarkkuus puolestaan on 500 CFU millilitrassa. Testeissä Streptococcus mitis reagoi tuottaen väärän positiivisen tuloksen, joten testiin valittu koetin ei ollut riittävän spesifinen. Seuraavat vaiheet testin kehittämisessä ovat pidemmän ja spesifisemmän koettimen, positiivisen kontrollitemplaatin (kohde-DNA:n kvantitatointi standardisuoralta) sekä sisäisen kontrollitemplaatin (testin toiminnan ja negatiivisten tulosten varmentaminen) suunnittelu ja testaaminen.