U-2 OS -solun proteosomi- ja translaatiogeenien hiljentämisen vaikutus apoptoosiin
Perikangas-Hentunen, Hertta (2012)
Perikangas-Hentunen, Hertta
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012113017516
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012113017516
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopistossa Jussi Taipaleen systeemibiologian tutkimusryhmässä. Työn tavoitteena oli hiljentää osteosarkoomasolun proteosomi- ja translaatiogeenit ja tarkastella vaikutusta solun apoptoosiin.
Apoptoosi eli ohjelmoitu solukuolema on prosessi, jossa solu tappaa itsensä hallitusti saatuaan mitokondriolta tai solukalvon reseptorilta käskyn kuolla. Molempien käskyjen seurauksena DNA fragmentoituu ja solun tukiranka ja tumakalvo hajoavat. Monisoluiset organismit tarvitsevat apoptoosia vahingoittuneiden tai tarpeettomien solujen poistamiseen. Apoptoosissa solun morfologiset ja biokemialliset muutokset ovat pääosin kaspaasi-proteiinien aiheuttamia.
Tässä opinnäytetyössä hiljennettiin RNA-interferenssitekniikan avulla ihmisen osteosarkoomasolu U-2 OS:n proteosomeihin ja ribosomin rakenteeseen ja biogeneesiin vaikuttavat geenit ja tarkasteltiin vaikutusta apoptoosiin. Hiljennyksen seurauksena solun translaation ja proteolyysin oletettiin häiriintyvän. Hiljennykseen käytettiin pieniä kaksijuosteisia RNA-molekyyleja, siRNA:ita, jotka ovat spesifisiä valitulle kohdegeenille. siRNA-transfektion seurauksena mRNA fragmentoituu ja geenin ilmentyminen estyy.
Apoptoositasoa tarkasteltiin fluoresenssia ja luminesenssia mittaavien kittien avulla. Fluoresenssin mittaaminen Cell titer-blue -kitillä indikoi näytteessä olevien elävien solujen määrää ja luminesenssin mittaaminen Caspase 3/7 -kitillä solujen kaspaasiaktiivisuutta. Apoptoosin perustasona käytetään näytettä, joka on transfektoitu negatiivikontrolli siRNA:lla, joka ei ole spesifi millekkään ihmisen mRNA:lle. Kun saadut fluoresenssi- ja luminesenssiarvot suhteutetaan negatiivikontrolliin ja tämän jälkeen kaspaasiaktiivisuus jaetaan fluoresenssiarvoilla, saadaan tulokseksi suhdeluku, jolla voidaan arvioida apoptoosiaktiivisuutta suhteessa normaalisolun vastaavaan.
Työn lopputuloksena löydettiin useita geenejä, joiden hiljentämisellä oli apoptoosiin joko voimakas pro-apoptoottinen tai anti-apoptoottinen vaikutus. Tuloksia tullaan hyödyntämään jatkotutkimuksissa tutkittaessa apoptoosin säätelymekanismeja translaation tasolla. Seuraava tutkimuksen askel voisi olla esimerkiksi erilaisten proteiini-proteiini-interaktioiden tarkastelu.
Apoptoosi eli ohjelmoitu solukuolema on prosessi, jossa solu tappaa itsensä hallitusti saatuaan mitokondriolta tai solukalvon reseptorilta käskyn kuolla. Molempien käskyjen seurauksena DNA fragmentoituu ja solun tukiranka ja tumakalvo hajoavat. Monisoluiset organismit tarvitsevat apoptoosia vahingoittuneiden tai tarpeettomien solujen poistamiseen. Apoptoosissa solun morfologiset ja biokemialliset muutokset ovat pääosin kaspaasi-proteiinien aiheuttamia.
Tässä opinnäytetyössä hiljennettiin RNA-interferenssitekniikan avulla ihmisen osteosarkoomasolu U-2 OS:n proteosomeihin ja ribosomin rakenteeseen ja biogeneesiin vaikuttavat geenit ja tarkasteltiin vaikutusta apoptoosiin. Hiljennyksen seurauksena solun translaation ja proteolyysin oletettiin häiriintyvän. Hiljennykseen käytettiin pieniä kaksijuosteisia RNA-molekyyleja, siRNA:ita, jotka ovat spesifisiä valitulle kohdegeenille. siRNA-transfektion seurauksena mRNA fragmentoituu ja geenin ilmentyminen estyy.
Apoptoositasoa tarkasteltiin fluoresenssia ja luminesenssia mittaavien kittien avulla. Fluoresenssin mittaaminen Cell titer-blue -kitillä indikoi näytteessä olevien elävien solujen määrää ja luminesenssin mittaaminen Caspase 3/7 -kitillä solujen kaspaasiaktiivisuutta. Apoptoosin perustasona käytetään näytettä, joka on transfektoitu negatiivikontrolli siRNA:lla, joka ei ole spesifi millekkään ihmisen mRNA:lle. Kun saadut fluoresenssi- ja luminesenssiarvot suhteutetaan negatiivikontrolliin ja tämän jälkeen kaspaasiaktiivisuus jaetaan fluoresenssiarvoilla, saadaan tulokseksi suhdeluku, jolla voidaan arvioida apoptoosiaktiivisuutta suhteessa normaalisolun vastaavaan.
Työn lopputuloksena löydettiin useita geenejä, joiden hiljentämisellä oli apoptoosiin joko voimakas pro-apoptoottinen tai anti-apoptoottinen vaikutus. Tuloksia tullaan hyödyntämään jatkotutkimuksissa tutkittaessa apoptoosin säätelymekanismeja translaation tasolla. Seuraava tutkimuksen askel voisi olla esimerkiksi erilaisten proteiini-proteiini-interaktioiden tarkastelu.