Proteiinin isoelektrisen pisteen määritysmenetelmän kehittäminen
Auranen, Laura (2011)
Auranen, Laura
Turun ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201105096797
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201105096797
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin Turun yliopiston Biofysiikan laboratoriossa, biolääketieteen laitoksella. Opinnäytetyö oli osa projektia, jossa tutkimusalueena oli nanopartikkeliperusteisten epäspesifisten menetelmien kehittäminen proteiinin ominaisuuksien ja pitoisuuden määrittämiseen käyttäen aikaerotteista fluoresenssia. Työ vaatii määritysten parametrien optimoinnin sekä määrityksen tutkimista ja kehittämistä.
Työn tarkoituksena oli kehittää sekoita ja mittaa -tyyppinen menetelmä proteiinin isoelektrisen pisteen määrittämiseen. Optimoitiin menetelmää, jossa mikrotiitterilevyllä on valmiiksi kuivattuna adsorptiopuskurin komponentit eri pH:iden saavuttamiseksi. Käyttäjä voi siten lisätä vain proteiinin, nanopartikkelit ja dissosiaatiopuskurin. Tästä määritysmenetelmästä pyritään kehittämään nopeampi, edullisempi ja käyttäjäystävällisempi kuin olemassa olevat menetelmät.
Kehitetty mittausmenetelmä perustuu proteiinien erilaiseen adsorboitumiseen Eu(III)-kelaatilla leimattuihin polystyreenipartikkeleihin adsorptiopuskurin pH:sta riippuen. Proteiinien adsorboitumista mitattiin fluoresenssisignaalina, joka on korkeimmillaan proteiinin isoelektrisessä pisteessä ja sitä matalammissa pH:issa.
Menetelmää optimoitaessa löydettiin mittaukselle sopivat parametrit, joiden avulla pystyttiin määrittämään proteiinin isoelektrinen piste suunnilleen puolen pH -yksikön tarkkuudella. Optimoiduiksi parametreiksi saatiin: adsorptiopuskurina universaalipuskuri eri pH:issa ja puskurikomponentit kaivoissa, proteiinipitoisuus 0,21 mg/l ja tilavuus mikrotiitterilevyn kaivossa 70 µl, Eu(III)-partikkelien pitoisuutena 1,7*106/µl tilavuudessa 5 µl, dissosiaatiopuskurina 0,50 M glysiini (pH = 0,75) tilavuudessa 10 µl sekä mittausajankohtana noin 30 minuuttia dissosiaatiopuskurin lisäyksestä.
Työn tarkoituksena oli kehittää sekoita ja mittaa -tyyppinen menetelmä proteiinin isoelektrisen pisteen määrittämiseen. Optimoitiin menetelmää, jossa mikrotiitterilevyllä on valmiiksi kuivattuna adsorptiopuskurin komponentit eri pH:iden saavuttamiseksi. Käyttäjä voi siten lisätä vain proteiinin, nanopartikkelit ja dissosiaatiopuskurin. Tästä määritysmenetelmästä pyritään kehittämään nopeampi, edullisempi ja käyttäjäystävällisempi kuin olemassa olevat menetelmät.
Kehitetty mittausmenetelmä perustuu proteiinien erilaiseen adsorboitumiseen Eu(III)-kelaatilla leimattuihin polystyreenipartikkeleihin adsorptiopuskurin pH:sta riippuen. Proteiinien adsorboitumista mitattiin fluoresenssisignaalina, joka on korkeimmillaan proteiinin isoelektrisessä pisteessä ja sitä matalammissa pH:issa.
Menetelmää optimoitaessa löydettiin mittaukselle sopivat parametrit, joiden avulla pystyttiin määrittämään proteiinin isoelektrinen piste suunnilleen puolen pH -yksikön tarkkuudella. Optimoiduiksi parametreiksi saatiin: adsorptiopuskurina universaalipuskuri eri pH:issa ja puskurikomponentit kaivoissa, proteiinipitoisuus 0,21 mg/l ja tilavuus mikrotiitterilevyn kaivossa 70 µl, Eu(III)-partikkelien pitoisuutena 1,7*106/µl tilavuudessa 5 µl, dissosiaatiopuskurina 0,50 M glysiini (pH = 0,75) tilavuudessa 10 µl sekä mittausajankohtana noin 30 minuuttia dissosiaatiopuskurin lisäyksestä.