PCR-menetelmän optimointi, standardien kehittäminen ja potilasnäytteiden analysointi
Jakovleva, Jelena (2011)
Jakovleva, Jelena
Turun ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011092113150
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011092113150
Tiivistelmä
Tämän työn tarkoituksena oli optimoida reaaliaikainen PCR- reaktiomenetelmä, jolla saataisiin määritettyä potilasnäytteestä samanaikaisesti kolme influenssavirusta ja RS-virus. PCR-reaktiot suoritettiin RotorGene – laitteilla. Reaktioita tarkasteltiin aluksi Boxto-värillä virusten kolmois-, neli- ja yksittäisseoksilla. Lopulliset PCR-reaktiot tehtiin kahden influenssaviruksen ja RS-viruksen kolmoisseoksilla sekä kunkin viruksen yksittäisseoksilla koettimen mukana olleessa.
Lisäksi työssä kehitettiin influenssa A(H1N1)2009 virukselle sekä influenssa A-viruksille sopiva yleispätevä kopiolukustandardi. Standardimolekyylejä varten vertailtiin yleisimmin esiintyviä influenssavirusten kantoja. Influenssa A-viruksen standardimolekyyli valmistettiin eristämällä PCR-reaktiossa suunniteltujen alukkeiden avulla 889 bp:n pituinen DNA-jakso viruksen M-geenistä. Pandeemisen (H1N1)-viruksen standardimolekyyli eristettiin viruksen H-geeniin
alueelta (902 bp:n pituinen DNA-molekyyli) samoja menetelmiä käyttämällä H1N1-virukselle
spesifisiä alukkeita käyttäen. Saadut DNA-molekyylit kloonattiin plasmidivektoriin ja monistettiin standardimolekyylivektorit transformoimalla ne E.coliin. Lopuksi monistetut plasmidimolekyylit eristettiin bakteerista ja varmistettiin standardimolekyylien oikeellisuus ja toimivuus PCR-reaktiossa.
Työssä tarkistettiin influenssa A(H1N1)2009 suhteen laboratorioon tutkittaviksi saapuneita näytteitä. Tarkastettavien näytteiden otos oli 124 näytettä ja tarkastettavana kohteena oli alle 12-vuotiaiden lasten ryhmä. Potilasnäytteitä tutkittiin 12 respiratorisen viruksen kaupallisella multi-plex DPO- (Dual Priming Oligonucleotide) alukkeita hyödyntävällä multiplex PCR-menetelmällä ja saatuja viruslöydöksiä arvioitiin suhteessa influenssaepidemiaan.
Lisäksi työssä kehitettiin influenssa A(H1N1)2009 virukselle sekä influenssa A-viruksille sopiva yleispätevä kopiolukustandardi. Standardimolekyylejä varten vertailtiin yleisimmin esiintyviä influenssavirusten kantoja. Influenssa A-viruksen standardimolekyyli valmistettiin eristämällä PCR-reaktiossa suunniteltujen alukkeiden avulla 889 bp:n pituinen DNA-jakso viruksen M-geenistä. Pandeemisen (H1N1)-viruksen standardimolekyyli eristettiin viruksen H-geeniin
alueelta (902 bp:n pituinen DNA-molekyyli) samoja menetelmiä käyttämällä H1N1-virukselle
spesifisiä alukkeita käyttäen. Saadut DNA-molekyylit kloonattiin plasmidivektoriin ja monistettiin standardimolekyylivektorit transformoimalla ne E.coliin. Lopuksi monistetut plasmidimolekyylit eristettiin bakteerista ja varmistettiin standardimolekyylien oikeellisuus ja toimivuus PCR-reaktiossa.
Työssä tarkistettiin influenssa A(H1N1)2009 suhteen laboratorioon tutkittaviksi saapuneita näytteitä. Tarkastettavien näytteiden otos oli 124 näytettä ja tarkastettavana kohteena oli alle 12-vuotiaiden lasten ryhmä. Potilasnäytteitä tutkittiin 12 respiratorisen viruksen kaupallisella multi-plex DPO- (Dual Priming Oligonucleotide) alukkeita hyödyntävällä multiplex PCR-menetelmällä ja saatuja viruslöydöksiä arvioitiin suhteessa influenssaepidemiaan.