Metsämaan mikrobien molekyylibiologinen tunnistus denaturoivan geelielektroforeesin (DGGE) avulla

Abstract

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia metsämaan humusnäytteiden mikrobilajistoa molekyylibiologisin menetelmin. Työ toteutettiin Helsingin yliopiston Ympäristötieteiden laitoksella Lahdessa. Humusnäytteet olivat pitkäaikaisesta lannoituskokeesta, jossa maaperää oli lannoitettu typellä, tuhkalla sekä niiden yhdistelmällä. Työn tarkoituksena oli tarkastella, vaikuttavatko eri lannoituskäsittelyt maaperän mikrobilajistoon. Tutkitut mikrobiryhmät olivat sienet, bakteerit ja ammoniakkia hapettavat bakteerit (AOB).

Metsämaan humuksesta eristetyistä DNA-näytteistä tunnistettiin sienet monistamalla polymeraasiketjureaktiolla (PCR) sienten 18S rDNA -merkkigeenin ITS-aluetta. Bakteerit tunnistettiin monistamalla 16S rDNA -merkkigeeniä. AOB:t tunnistettiin monistamalla 16S rDNA -merkkigeeniä proteobakteereille selektiivisillä alukkeilla nested PCR -menetelmällä. Monistetut PCR-tuotteet eroteltiin denaturoivalla gradienttigeelielektroforeesilla (DGGE). Erotetut DNA-jaksot monistettiin uudestaan ja sekvensoitiin Biotekniikan Instituutissa Helsingissä. Sekvenssit tulkittiin bioinformatiikan työkalujen avulla.

Kaikkien metsämaan mikrobiryhmien DGGE-analyyseissä onnistuttiin sekvensoimaan ja tunnistamaan eri fylotyyppejä. Parhaat tulokset saavutettiin sienten osalta. Bakteerien ja AOB:n osalta menetelmät kaipaavat vielä optimointia humusmaanäytteitä varten. Metsämaan mikrobilajistoissa havaittiin eroja eri lannoituskäsittelyiden välillä. Suurimmat erot olivat sieni- ja AOB-lajistoissa, joilla lajistot olivat kaikissa käsittelyissä erilaiset. Tulosten perusteella sieni- ja AOB-lajistot ovat herkimpiä lannoituskäsittelyiden vaikutuksille. Vähiten eroja lannoituskäsittelyiden kesken oli bakteerilajistossa.

The aim of this graduate study was to analyze the microbial fauna in forest humus soil by using molecule biological methods. The study was carried out at the University of Helsinki, Department of Environmental Sciences in Lahti, Finland. The Soil samples were taken from a long-term fertilization experiment in which soil was fertilized with nitrogen, ash and a combination of those two. The purpose was to examine the effect of different fertilization treatments on soil microbial fauna. The studied microbial groups were fungi, bacteria and ammonia oxidizing bacteria (AOB).

The Fungi were identified from soil DNA samples by multiplying ITS-region of 18S rDNA gene with polymerase chain reaction (PCR). The Bacteria were identified by multiplying 16S rDNA gene. AOB were identified by multiplying 16S rDNA gene with nested PCR -method using primers selective to proteobacteria. PCR-products were separated with Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). DNA was multiplied again and sequenced in The Institute of Biotechnology in Helsinki, Finland. The Sequences were interpreted with bioinformatics tools.

DGGE-analyses for all three microbial groups were implemented successfully. Fylotypes from all three microbial groups were sequenced and identified. The Best results were achieved by the fungi. The Methods for analysing bacteria and AOB still require optimization. Differences between the fertilization treatments were observed. The main differences were detected in fungi and AOB fauna. According to the results, the fungi and AOB fauna are the most sensitive for fertilization treatments, whereas the differences were the least in bacteria fauna.