Biologisesti aktiivisen R-Spondin-1-proteiinin tuotto ja puhdistus
Kärnä, Janne (2019)
Kärnä, Janne
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019060314534
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019060314534
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö tehtiin Tampereen yliopiston BioMediTechin Proteiinidynamiikan tutkimusryhmälle Suolen signaloinnin epigenetiikka -tutkimusryhmän toimeksiannosta. Työn tavoitteena oli kehittää menetelmä R-Spondin-1-proteiinin tuottamiseksi omassa laboratoriossa. Työn tarkoituksena oli tuottaa proteiinia ensisijaisesti mammaalisoluissa ja toissijaisesti hyönteissoluissa, sekä varmistaa puhdistettujen tuotteiden biologinen aktiivisuus kokeellisesti.
Tuotettu proteiini on tarpeellinen osa suolen kantasolujen kasvatuksessa. Ilman proteiinin läsnäoloa kantasolut erilaistuvat spontaanisti suolen eri rakennesoluiksi. Suolen organoidien in vitro -kasvatuksessa saa proteiinin läsnäolo aikaan kryptien kehittymisen ja kasvun organoideissa.
Proteiinia ekspressoitiin HEK-293 mammaalisoluissa sekä Sf9-, High Five- ja Tni-FNL-hyönteissoluissa. Tuotettu proteiini puhdistettiin affiniteettikromatografialla siihen liitetyn Twin-Strep-puhdistuskahvan avulla. Lopuksi tuotetun proteiinin biologinen aktiivisuus varmistettiin viljelemällä ihmisen ohutsuolen organoideja ja laskemalla organoideihin kasvaneiden kryptien lukumäärät. Samalla verrattiin itse tuotetun proteiinin aktiivisuutta kaupallisesti saatavilla olevaan proteiiniin.
Työn ensisijainen tavoite saavutettiin ja tuotetun proteiinin biologinen aktiivisuus todettiin kaupalliseen tuotteeseen verrattavaksi. Aktiivisuustestissä 1000 ng/ml pitoisuudella itse tuotetun proteiinin aktiivisuus oli noin 85% kaupallisen proteiinin aktiivisuudesta. Toissijaista tavoitetta ei saavutettu, sillä hyönteissoluissa tuotetun proteiinin määrä jäi pieneksi ja se lopulta kadotettiin täysin puhdistusvaiheessa.
Tuotettu proteiini on tarpeellinen osa suolen kantasolujen kasvatuksessa. Ilman proteiinin läsnäoloa kantasolut erilaistuvat spontaanisti suolen eri rakennesoluiksi. Suolen organoidien in vitro -kasvatuksessa saa proteiinin läsnäolo aikaan kryptien kehittymisen ja kasvun organoideissa.
Proteiinia ekspressoitiin HEK-293 mammaalisoluissa sekä Sf9-, High Five- ja Tni-FNL-hyönteissoluissa. Tuotettu proteiini puhdistettiin affiniteettikromatografialla siihen liitetyn Twin-Strep-puhdistuskahvan avulla. Lopuksi tuotetun proteiinin biologinen aktiivisuus varmistettiin viljelemällä ihmisen ohutsuolen organoideja ja laskemalla organoideihin kasvaneiden kryptien lukumäärät. Samalla verrattiin itse tuotetun proteiinin aktiivisuutta kaupallisesti saatavilla olevaan proteiiniin.
Työn ensisijainen tavoite saavutettiin ja tuotetun proteiinin biologinen aktiivisuus todettiin kaupalliseen tuotteeseen verrattavaksi. Aktiivisuustestissä 1000 ng/ml pitoisuudella itse tuotetun proteiinin aktiivisuus oli noin 85% kaupallisen proteiinin aktiivisuudesta. Toissijaista tavoitetta ei saavutettu, sillä hyönteissoluissa tuotetun proteiinin määrä jäi pieneksi ja se lopulta kadotettiin täysin puhdistusvaiheessa.