Afgaaninvinttikoiran hemofilia A:han liittyvien ehdokasgeenivarianttien validointi

Abstract

Tämän työn tarkoituksena oli tutkia kahta geneettistä varianttia, joiden epäillään aiheuttavan hemofilia A:n afgaaninvinttikoiralla. Hemofilia A on perinnöllinen verenvuototauti, jota esiintyy monilla lajeilla, ihminen ja koira mukaan lukien. Koirangeenit-tutkimusryhmän tekemät varianttilöydöt sijaitsevat F8-geenissä, ja tämän työn tarkoitus oli validoida nämä ehdokasvariantit. Variantit löydettiin analysoitaessa sairaan yksilön eksomisekvensointiaineistoa.

F8-geenin eksonissa 14 sijaitsevan pistemutaation validointia varten näytteiksi valittiin 24 tervettä sairaan yksilön sukulaista. Testatuista koirista viidellä uroskoiralla oli hemitsygoottisena tutkittava variantti ja kahdeksan naarasta oli kantajia. Sairaan yksilön fenotyyppi oli hyvin vakava hemofilia, joten terveet genotyypiltään hemitsygootit yksilöt todistavat hypoteesia vastaan. Eksonissa 14 sijaitseva kandidaattivariantti ei siis todennäköisesti aiheuta hemofiliaa afgaaninvinttikoirilla, ainakaan yksinään. Eksonin 13 silmukointialueelta löytyneen insertiomutaation selvittelyssä sekvensoitiin yhteensä 19 koiraa, joista neljällä terveellä sukulaisella oli sama genotyyppi kuin sairaalla uroksella. Jos tulokset olisivat olleet lupaavia, olisi näytteitä analysoitu enemmän, mutta tämä määrä riitti todistamaan, että nämä variantit eivät todennäköisesti aiheuta sairautta.

Tutkimusaineistona olivat suomalaiset puhdasrotuiset afgaaninvinttikoirat, joista omistaja oli luovuttanut EDTA-verinäytteet koirien DNA-pankkiin. Tutkittaville varianteille suunniteltiin alukkeet PCR- ja sekvensointireaktioita varten. DNA:ta monistettiin PCR-menetelmällä, ja ulkopuolinen taho suoritti sekvensoinnin kapillaarisekvensoinnilla. Tuloksia käsiteltiin Sequencher-ohjelmalla.

Tässä tutkimuksessa ei voitu poissulkea mutaatioiden osallisuutta monitekijäisessä hemofiliassa. Tutkimusta jatketaan keskittymällä mutaatioihin von Willebrandin tekijää koodaavassa geenissä. Näiden proteiinirakenteita muuttavien mutaatioiden yhteisvaikutus F8-geenin mutaatioiden kanssa voi olla hyytymistekijä VIII:n vajeen taustalla. Geenivirheen löytäminen mahdollistaisi geenitestin kehittämisen koirien jalostuksen avuksi.

The purpose of this study was to investigate two gene variants of an Afghan Hound that was diagnosed with hemophilia A. The variants are in the gene that codes factor VIII, which is important part of the coagulation cascade. The goal of this study was to validate if the previously found missense mutation in exon 14 and the 1 bp insertion mutation in the splicing area of exon 13 as the cause of hemophilia in the affected individual. The affected dog’s phenotype was severe hemophilia and the dog had to be euthanized because of it. Therefore, clinically healthy hemizygote were not expected.

A sample set of 24 healthy relatives of the affected dog was chosen for the investigation of the missense mutation. From the tested dogs five males had the same genotype as the affected individual and eight bitches were carriers of the mutation. This indicates strongly that the studied missense mutation is not causative. For the insertion, 19 samples were sequenced, of which 4 healthy male dogs were carriers. Had the results been more promising, more samples would have been sequenced, but this was large enough to prove the studied variants were not the cause of the illness, at least not alone.

The study cohort in this study included Finnish purebred, privately owned Afghan Hounds, of which EDTA blood samples had been donated to the Canine DNA bank. Primers were designed for both variants with Primer3 and DNA amplified in PCR reactions. Products were subsequently Sanger sequenced and data was visualized with Sequencher DNA sequence analysis software.

These results do not exclude the possibility of the mutations being affecting factors of multifactorial inheritance. The research will continue with checking variants in the gene that codes the von Willebrand factor. These missense mutations combined with the mutations in F8-gene might cause factor VIII deficiency. If the causative variant is found, a gene test could be developed. Testing dogs would benefit breeding and support a healthier future for dogs.