Kasvatusolosuhteiden vaikutus kaksoisjuoste-RNA-virusten esiintymiseen juurikäävässä
Jalo, Erja (2008)
Jalo, Erja
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2008
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200812044239
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200812044239
Tiivistelmä
Insinöörityön tarkoituksena oli selvittää, voidaanko juurikääpävirusten puhdasviljelmissä esiintyvien virusten pitoisuutta lisätä. Juurikääpärihmaston puhdasviljelmiä kasvatetaan juurikääpävirusten määritykseen liittyviin tutkimuksiin. Lisääntynyt viruspitoisuus tutkittavassa näytteessä vahvistaisi tutkimustulosten tulkittavuutta ja luotettavuutta, helpottaisi virusten määritystyötä jatkotutkimuksissa ja vähentäisi työstä aiheutuvia kustannuksia.
Työssä valmistettiin erilaisia kompleksisia kasvualustoja ja yksi synteettinen kasvualusta, joiden vaikutusta juurikääpärihmaston kasvuun ja viruspitoisuuden muutoksiin tutkittiin. Kasvualustat olivat synteettinen Hagem-agar, kuusenneulasuutetta sisältävä MOS (modified orange serum) -agar, kuusen purua sisältävä MOS-agar ja V8-agar, joka sisältää vihannesmehua. Lisäksi MOS-agarilla kasvatettiin 28 °C:ssa yleensä kasvatuslämpötilana käytetyn 22 °C:n sijaan.
Viruksen pitoisuuden toteamiseksi virusperäiset RNA-molekyylit puhdistettiin sienirihmastosta ja muista nukleiinihapoista käyttämällä hyväksi kaksoisjuoste-RNA:n spesifistä sitoutumista CF-11-selluloosakuituun. Menetelmä perustuu selluloosakuidun nukleiinihappojen affiniteettiin ja 15-prosenttisessa etanolikonsentraatiossa tapahtuvaan kaksoisjuoste-RNA:n adsorptioon. Kaksoisjuoste-RNA-eristysmenetelmään sisältyi mm. solujen rikkominen kemiallisesti ja homogenisaattorilla, puhdistus fenoli- ja kloroformiuutoilla, näytteiden pesu kolonnien läpi pesupuskureilla sekä lopuksi geelielektroforeesiajo.
Työn tuloksista ilmeni, että juurikäävän rihmaston kasvua voidaan nopeuttaa ja lisätä käyttämällä sopivaa kasvualustaa sekä lisätä juurikäävän viruspitoisuutta juurikääpärihmastossa. Epäsopiva kasvualusta tai olosuhteet taas heikentävät rihmaston kasvua ja vähentävät viruspitoisuutta.
Kasvualustoista parhaimman tuloksen viruspitoisuuden ja juurikääpärihmaston kasvun kannalta antoi kuusenpuru-MOS-agar. Tätä agaria voidaan käyttää jatkotutkimuksissa pienen viruspitoisuuden omaaville juurikääpäkannoille. Tämän työn tulosten valossa myös uusia kasvualustoja tullaan kokeilemaan virussaannon lisäämiseksi juurikääpärihmastossa.
Työssä valmistettiin erilaisia kompleksisia kasvualustoja ja yksi synteettinen kasvualusta, joiden vaikutusta juurikääpärihmaston kasvuun ja viruspitoisuuden muutoksiin tutkittiin. Kasvualustat olivat synteettinen Hagem-agar, kuusenneulasuutetta sisältävä MOS (modified orange serum) -agar, kuusen purua sisältävä MOS-agar ja V8-agar, joka sisältää vihannesmehua. Lisäksi MOS-agarilla kasvatettiin 28 °C:ssa yleensä kasvatuslämpötilana käytetyn 22 °C:n sijaan.
Viruksen pitoisuuden toteamiseksi virusperäiset RNA-molekyylit puhdistettiin sienirihmastosta ja muista nukleiinihapoista käyttämällä hyväksi kaksoisjuoste-RNA:n spesifistä sitoutumista CF-11-selluloosakuituun. Menetelmä perustuu selluloosakuidun nukleiinihappojen affiniteettiin ja 15-prosenttisessa etanolikonsentraatiossa tapahtuvaan kaksoisjuoste-RNA:n adsorptioon. Kaksoisjuoste-RNA-eristysmenetelmään sisältyi mm. solujen rikkominen kemiallisesti ja homogenisaattorilla, puhdistus fenoli- ja kloroformiuutoilla, näytteiden pesu kolonnien läpi pesupuskureilla sekä lopuksi geelielektroforeesiajo.
Työn tuloksista ilmeni, että juurikäävän rihmaston kasvua voidaan nopeuttaa ja lisätä käyttämällä sopivaa kasvualustaa sekä lisätä juurikäävän viruspitoisuutta juurikääpärihmastossa. Epäsopiva kasvualusta tai olosuhteet taas heikentävät rihmaston kasvua ja vähentävät viruspitoisuutta.
Kasvualustoista parhaimman tuloksen viruspitoisuuden ja juurikääpärihmaston kasvun kannalta antoi kuusenpuru-MOS-agar. Tätä agaria voidaan käyttää jatkotutkimuksissa pienen viruspitoisuuden omaaville juurikääpäkannoille. Tämän työn tulosten valossa myös uusia kasvualustoja tullaan kokeilemaan virussaannon lisäämiseksi juurikääpärihmastossa.