Väriaineet pipetoinnin apuna qPCR-tekniikassa
Uusivirta, Sanna (2008)
Uusivirta, Sanna
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2008
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200812044253
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200812044253
Tiivistelmä
Polymeraasiketjureaktion (PCR) yhteydessä on perinteisesti käytetty väriaineita apuna analysoitaessa reaktioita agaroosigeelielektroforeesilla (AGE). Ennen AGE:a näytteisiin lisätään värillinen puskuri, joka muun muassa helpottaa näytteiden pipetointia geelille. Markkinoilla on myös DNA-polymeraaseja, joissa väri on jo valmiina. Näissä entsyymiliuoksissa väri toimii pipetointiapuna, sekä helpottaa DNA-fragmenttien liikkuvuuden arviointia AGE:ssa.
Tässä työssä tutkittiin erilaisten väriaineiden vaikutusta qPCR-reaktioihin (engl. Quantitative Polymerase Chain Reaction) ja reaktioseosten säilyvyyteen ajatuksena lisätä väriaineita Finnzymes Oy:n valmistamiin valmiisiin qPCR reaktioseoksiin eli master mix -seoksiin ja käyttää kyseisiä väriaineita pipetointiapuna reaktioseosta tehdessä ja pipetoidessa.
Väriaineiden vaikutusta qPCR-reaktioihin testattiin lisäämällä erilaisia väriaineita reaktioseoksiin ennen PCR-reaktioita. Reaktioihin tarvittava värin määrä arvioitiin visuaalisesti eri reaktioastiatyypeillä ja jokaisesta väriaineesta testattiin useampaa pitoisuutta. Lisäksi väriaineiden sopivuutta qPCR:oon tutkittiin mittaamalla niiden spektrejä ja fluoresenssitasoja, sillä qPCR:n kvantitointi perustuu fluoresoivien värien käyttöön. Näitä spektrejä verrattiin yleisimpien qPCR:ssa käytettyjen fluoroforien eksitaatio- ja emissiospektreihin.
Ensimmäinen qPCR-ajo, jossa värejä testattiin, perustui SYBR® Green I -detektointikemiaan. Niitä värejä, joiden ei havaittu aiheuttavan merkittävää haittaa reaktiolle ensimmäisessä qPCR-ajossa, testattiin myös multiplex-qPCR-ajossa. Kaikissa qPCR-ajoissa värillisiä reaktioita verrattiin muuten samanlaisiin, mutta värittömiin reaktioihin. Parhaimmaksi väriksi osoittautui näiden ajojen perusteella väri 5. Kyseinen väri ei inhiboinut PCR:n monistumista eikä haitannut merkittävästi fluoresenssin detektointia. Multiplex-PCR:ssa väri 5 häiritsi detektointia aallonpituusalueella 600 - 630 nm.
Säilyvyyskokeissa väriä 5 lisättiin erilaisiin master mix -seoksiin. Säilyvyyttä tutkittiin tekemällä funktionaalisia testejä eri olosuhteissa säilytetyille, väriä sisältäville qPCR-reaktioseoksille. Näissä testeissä värillä 5 ei todettu olevan vaikutusta master mix -seosten säilyvyyteen.
Värillisten master mix -seosten tuotantoa ei vielä aloitettu pelkästään näiden tulosten perusteella. Värin 5 testausta jatketaan muun muassa pidentämällä säilyvyyskokeita kuuteen kuukauteen. Tulevaisuudessa tullaan luultavasti testamaan lisää väriaineita tarkoituksena löytää myös multiplex-PCR:oon soveltuva väriaine.
Tässä työssä tutkittiin erilaisten väriaineiden vaikutusta qPCR-reaktioihin (engl. Quantitative Polymerase Chain Reaction) ja reaktioseosten säilyvyyteen ajatuksena lisätä väriaineita Finnzymes Oy:n valmistamiin valmiisiin qPCR reaktioseoksiin eli master mix -seoksiin ja käyttää kyseisiä väriaineita pipetointiapuna reaktioseosta tehdessä ja pipetoidessa.
Väriaineiden vaikutusta qPCR-reaktioihin testattiin lisäämällä erilaisia väriaineita reaktioseoksiin ennen PCR-reaktioita. Reaktioihin tarvittava värin määrä arvioitiin visuaalisesti eri reaktioastiatyypeillä ja jokaisesta väriaineesta testattiin useampaa pitoisuutta. Lisäksi väriaineiden sopivuutta qPCR:oon tutkittiin mittaamalla niiden spektrejä ja fluoresenssitasoja, sillä qPCR:n kvantitointi perustuu fluoresoivien värien käyttöön. Näitä spektrejä verrattiin yleisimpien qPCR:ssa käytettyjen fluoroforien eksitaatio- ja emissiospektreihin.
Ensimmäinen qPCR-ajo, jossa värejä testattiin, perustui SYBR® Green I -detektointikemiaan. Niitä värejä, joiden ei havaittu aiheuttavan merkittävää haittaa reaktiolle ensimmäisessä qPCR-ajossa, testattiin myös multiplex-qPCR-ajossa. Kaikissa qPCR-ajoissa värillisiä reaktioita verrattiin muuten samanlaisiin, mutta värittömiin reaktioihin. Parhaimmaksi väriksi osoittautui näiden ajojen perusteella väri 5. Kyseinen väri ei inhiboinut PCR:n monistumista eikä haitannut merkittävästi fluoresenssin detektointia. Multiplex-PCR:ssa väri 5 häiritsi detektointia aallonpituusalueella 600 - 630 nm.
Säilyvyyskokeissa väriä 5 lisättiin erilaisiin master mix -seoksiin. Säilyvyyttä tutkittiin tekemällä funktionaalisia testejä eri olosuhteissa säilytetyille, väriä sisältäville qPCR-reaktioseoksille. Näissä testeissä värillä 5 ei todettu olevan vaikutusta master mix -seosten säilyvyyteen.
Värillisten master mix -seosten tuotantoa ei vielä aloitettu pelkästään näiden tulosten perusteella. Värin 5 testausta jatketaan muun muassa pidentämällä säilyvyyskokeita kuuteen kuukauteen. Tulevaisuudessa tullaan luultavasti testamaan lisää väriaineita tarkoituksena löytää myös multiplex-PCR:oon soveltuva väriaine.