2A-proteaasien kloonaus, tuotto ja karakterisointi
Soosaar, Meelike (2016)
Soosaar, Meelike
Tampereen ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016120419027
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016120419027
Tiivistelmä
Enterovirus-suvun edustajat tunnetaan laajalti patogeeneinä, jotka aiheuttavat ihmisille muun muassa polion, enterorokon, yleisen flunssan ja sydänläppätulehduksen kaltaisia tauteja. Viruksen lisääntymisen ja siten infektioiden leviämisen kannalta olennaisessa roolissa ovat viruksen omat post-translationaaliset polypeptidin pilkkoutumiseen osallistuvat 2A- ja 3C-proteaasit. Tutkimalla kyseisten proteaasien aktiivisuuksia ja etsimällä niiden aktiivisuutta inhiboivia yhdisteitä, voidaan mahdollisesti kehittää antiviraalisia yhdisteitä, joilla estetään virusten aiheuttamia vakavia tauteja.
Työn tavoitteena oli tuottaa 2A-proteaaseja E.coli-bakteerisoluissa ja tutkia niiden ominaisuuksia sekä mahdollista aktiivisuutta. Työn kohteena oli yhdeksän eri enteroviruslajin 2A-proteaasia. Työn tarkoituksena oli kloonata histagilliset 2A-proteaasien geenit osaksi plasmidi-vektoria ja transformoida ne haluttua proteiinia yli-ilmentäviin E.coli-bakteerisoluihin. Tuotto-olosuhteiden optimoinnin jälkeen 2A-proteaasit puhdistettiin affiniteettikromatografialla, jonka jälkeen niiden ominaisuuksia tutkittiin erilaisin biokemiallisin menetelmin. Työ suoritettiin Tampereen Yliopiston proteiinidynamiikan tutkimusryhmään vakiintuneilla ja hyväksi todetuilla biokemiallisilla menetelmillä.
Työn tulokset olivat mielenkiintoiset ja paikoin odottamattomat. Suurin osa kohdeproteiineista tuottuivat. Kuitenkin johtuen joidenkin proteiinien pienestä konsentraatiosta, niiden havaitseminen ei ollut selkeää vasta-ainevärjäyksissä. Samasta syystä myös aktiivisuuskokeiden ja vasta-ainevärjäysten tulokset olivat paikoin ristiriidassa. Useassa tapauksessa proteiinia menetettiin dialyysissä aggregoitumisen vuoksi. Kaikilla aktiivisuuskokeissa mukana olleilla 2A-proteaaseilla mitattiin kyky pilkkoa kohdepeptidiä. Työn ohella, ilman varsinaista tarkoitusta, todettiin nikkelin ja EDTA:n vaikuttavan merkittävästi 2A-proteaasien aktiivisuuksiin.
Työ tehtiin osana suurempaa virustutkimusta ja työn tuotteita sekä tuloksia tullaan käyttämään tulevaisuudessa tieteellisen julkaisun kirjoittamiseen ja jatkotutkimuksien tekemiseen. Proteaasien tutkimus jatkuu eri 2A-proteaasien kineettisten ominaisuuksien määrittämisen sekä niiden aktiivisuutta inhiboivien pienmolekyylien etsimisen parissa.
Työn tavoitteena oli tuottaa 2A-proteaaseja E.coli-bakteerisoluissa ja tutkia niiden ominaisuuksia sekä mahdollista aktiivisuutta. Työn kohteena oli yhdeksän eri enteroviruslajin 2A-proteaasia. Työn tarkoituksena oli kloonata histagilliset 2A-proteaasien geenit osaksi plasmidi-vektoria ja transformoida ne haluttua proteiinia yli-ilmentäviin E.coli-bakteerisoluihin. Tuotto-olosuhteiden optimoinnin jälkeen 2A-proteaasit puhdistettiin affiniteettikromatografialla, jonka jälkeen niiden ominaisuuksia tutkittiin erilaisin biokemiallisin menetelmin. Työ suoritettiin Tampereen Yliopiston proteiinidynamiikan tutkimusryhmään vakiintuneilla ja hyväksi todetuilla biokemiallisilla menetelmillä.
Työn tulokset olivat mielenkiintoiset ja paikoin odottamattomat. Suurin osa kohdeproteiineista tuottuivat. Kuitenkin johtuen joidenkin proteiinien pienestä konsentraatiosta, niiden havaitseminen ei ollut selkeää vasta-ainevärjäyksissä. Samasta syystä myös aktiivisuuskokeiden ja vasta-ainevärjäysten tulokset olivat paikoin ristiriidassa. Useassa tapauksessa proteiinia menetettiin dialyysissä aggregoitumisen vuoksi. Kaikilla aktiivisuuskokeissa mukana olleilla 2A-proteaaseilla mitattiin kyky pilkkoa kohdepeptidiä. Työn ohella, ilman varsinaista tarkoitusta, todettiin nikkelin ja EDTA:n vaikuttavan merkittävästi 2A-proteaasien aktiivisuuksiin.
Työ tehtiin osana suurempaa virustutkimusta ja työn tuotteita sekä tuloksia tullaan käyttämään tulevaisuudessa tieteellisen julkaisun kirjoittamiseen ja jatkotutkimuksien tekemiseen. Proteaasien tutkimus jatkuu eri 2A-proteaasien kineettisten ominaisuuksien määrittämisen sekä niiden aktiivisuutta inhiboivien pienmolekyylien etsimisen parissa.