Transkriptiotekijä MAL:n ja tumalevyproteiinien välisten vuorovaikutusten tutkiminen immunosaostusmenetelmällä

Abstract

Opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää transkriptiotekijä MAL:n ja hiiren tumalevyproteiinien (Lamiini B -reseptori LBR, Laminaan sitoutuva polypeptidi-2 Lap2 ja emeriini) välillä olevasta mahdollisesta vuorovaikutuksesta immunosaostusmenetelmällä. Projekti tehtiin yhdessä väitöskirjatutkijan kanssa Helsingin yliopiston Biotekniikan Instituutissa Maria Vartiaisen johtamassa kansainvälisessä tutkimusryhmässä.

Projekti aloitettiin monistamalla spesifisillä alukkeilla hiiren geeniä, joka tuottaa tuman sisemmälle membraanikalvolle kiinnittymätöntä proteiinin osaa Lap2Ɛ:sta eli aminohappoja 1-409. Insertti liitettiin pENTR/D-TOPO-kloonausmenetelmällä TOPO-vektoriin. Menetelmällä saatu pENTR liitettiin HA- ja FLAG-destinaatiovektoreihin Gateway-kloonauksella. Muut tutkittavat tumalevyproteiinit sekä projektissa käytetty transkriptiotekijä MAL ja sen muunnelmat (MAL-NLS, MAL***, RPEL ja MALΔRPEL) löytyivät jo ryhmän käytöstä. Tutkittavia proteiineja tuottavat plasmidit transfektoitiin jetPRIME-reagenssilla hiiren alkiosta alunperin eristettyyn jatkuvaan solulinjaan NIH/3T3-fibroblastisoluihin. Ilmenemistason määrityksellä huomattiin, että solut eivät kyenneet tuottamaan samalla tasolla muokattuja tumalevyproteiineja verrattuna niiden täyspitkiin muotoihin. Solujen värjäyksellä saatiin lisätietoa proteiinien sijoittumisesta soluissa. Transmembraanidomeenin puuttuminen muokatuilla tumalevyproteiineilla mahdollisti niiden sijoittumisen tumaan.

Immunosaostusmenetelmällä tutkittiin tumalevyproteiinien ja MAL:n välistä vuorovaikutusta. Lap2Ɛ- ja LBR-proteiinien välisestä vuorovaikutuksesta transkriptiotekijä MAL:n kanssa ei voida näiden tutkimuksien perusteella sanoa mitään. Niiden ilmenemistasoa soluissa pitäisi saada kasvatettua, jotta vuorovaikutusta voitaisiin kunnolla tutkia. Emeriinin ja MAL:n välillä havaittiin kuitenkin vuorovaikutusta, kun agaroosihelmien avulla kiinnitettiin ensin emeriini ja tutkittiin MAL:n kiinnittymistä emeriiniin. Toisinpäin vuorovaikutusta ei kuitenkaan havaittu.

Immunosaostus menetelmänä on haastava ja monivaiheinen. Analyysit pitäisi toistaa useaan kertaan samoissa olosuhteissa ja saada samanlaisia tuloksia, jotta vuorovaikutuksesta voitaisiin olla varmoja. Massaspektrometrillä ja immunosaostuksella saadut vihjeet osoittavat kuitenkin, että vuorovaikutusta proteiinien välillä saattaa olla.

The aim of the project was to study interactions between transcription factor MAL and lamina proteins (Lamin B receptor LBR, Lamina-associated polypeptide Lap2 and emerin) by co-immunoprecipitation. The project was done together PhD student in Maria Vartiainen’s international research group at the Institute of Biotechnology. It is an independent research institute at the University of Helsinki.

The project started with amplifying with specific primers the sequence encoding amino acids 1-409 from Lap2Ɛ mouse gene. This produces a protein that is not attached to the inner nuclear membrane. Insert was cloned to TOPO-vector using pENTR/D-TOPO cloning kit. The inserts were subsequently cloned into HA- and FLAG-destination vectors using Gateway cloning kit. Other lamina proteins, as well as MAL and its different constructs (MAL-NLS, MAL***, RPEL and MALΔRPEL), were already available in the group. All proteins were produced from mouse genes and were grown in mouse fibroblast NIH/3T3 cells. Plasmids expressing the proteins of interest were transfected to NIH/3T3 fibroblast cells with jetPRIME-reagent.

Test expression of the proteins showed that cells cannot express truncated versions of the lamina proteins (Lap2Ɛ and LBR) at the same level as their full length versions. Information about protein localization was gained with cell staining. The absence of the transmembrane domain in truncated versions of proteins allowed placement of proteins inside the nucleus.

Interactions between lamina proteins and MAL were studied by co-immunoprecipitation. Interaction between Lap2 and LBR with MAL did not give any results because of their low expression level in cells. However, interaction between emerin and MAL-NLS was detected.

This method is complicated and has many different steps which increases the risk of wrong results. To be sure about the interactions between studied proteins, the experiments should be repeated several times. Nonetheless, the data of mass spectrometry and co-immunoprecipitation showed that there might be interactions between these proteins.