Peptide break -teknologian karakterisointi QRET-tekniikan avulla
Laine, Mari (2017)
Laine, Mari
Turun ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017052410062
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017052410062
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin Turun yliopiston kemian laitoksen tutkimusryhmässä ja tarkoituksena oli karakterisoida peptide break -teknologiaa ja löytää uusia työkaluja vasta-aineettoman entsyymiaktiivisuusmenetelmän kehittämiseen. Oletuksena on, että mitä pidempi peptidi sitä suurempi affiniteetti. Peptide break -teknologia perustuu luminesenssisignaalin muutoksiin, jotka johtuvat proteiinin jälkitranslaation modifikaatioista. Entsyymiaktiivisuusmenetelmän kehityksessä on hyödynnetty soluissa syntyviä leusiinivetoketjuja, jotka muodostavat kolmiulotteisen rakenteen. Tämän kolmiulotteisen rakenteen arvellaan olevan haitaksi proteiinin translaation jälkeisten modifikaatioiden tutkimisessa.
Työssä tutkittiin kahta entsymaattista reaktiota. Nämä olivat fosforylaatio sekä deasetylaatio. Karakterisoinnissa käytettiin sammutusresonanssienergiansiirtotekniikkaa (QRET). Menetelmä perustuu homogeenisessä liuoksessa olevien substraattipeptidin ja leimatun peptidin sitoutumisen havainnointiin liukoisen sammuttajan avulla. Fosforyloitunut tai asetyloitunut substraattipeptidi ei sitoudu leimattuun peptidiin, ja näin ollen leimattu peptidi on vapaana liuoksessa. Tällöin liukoinen sammuttaja pääsee vuorovaikutukseen leiman kanssa, hiljentäen signaalin. Proteiinin jälkitranslaatiomodifikaatioryhmän poiston jälkeen substraatti ja leimattu ligandi sitoutuvat toisiinsa ja tämä sitoutuminen suojaa ligandin europium-leimaa. Tällöin liukoinen sammuttaja ei pääse vuorovaikutukseen leimatun ligandin kanssa, eikä voi hiljentää signaalia, vaan mitataan korkea aikaerotteinen luminesenssi.
Tulokseksi saatiin, että leusiinivetoketjun muodostama kolmiulotteinen rakenne ei haittaa proteiinin jälkitranslaation modifikaatioiden detektointia. Pitkillä peptideillä todettiin olevan suuri sitoutumisaffiniteetti, jolloin saatiin liian matala signaalin ja taustan suhde. Affiniteetin alentamiseksi peptidejä tulisi muokata lyhyemmiksi ja vähemmän varautuneiksi. SIRT1-entsyymin konsentraatio deasetylaatiossa oli liian matala ja konsentraatiota tulisi nostaa.
Työssä tutkittiin kahta entsymaattista reaktiota. Nämä olivat fosforylaatio sekä deasetylaatio. Karakterisoinnissa käytettiin sammutusresonanssienergiansiirtotekniikkaa (QRET). Menetelmä perustuu homogeenisessä liuoksessa olevien substraattipeptidin ja leimatun peptidin sitoutumisen havainnointiin liukoisen sammuttajan avulla. Fosforyloitunut tai asetyloitunut substraattipeptidi ei sitoudu leimattuun peptidiin, ja näin ollen leimattu peptidi on vapaana liuoksessa. Tällöin liukoinen sammuttaja pääsee vuorovaikutukseen leiman kanssa, hiljentäen signaalin. Proteiinin jälkitranslaatiomodifikaatioryhmän poiston jälkeen substraatti ja leimattu ligandi sitoutuvat toisiinsa ja tämä sitoutuminen suojaa ligandin europium-leimaa. Tällöin liukoinen sammuttaja ei pääse vuorovaikutukseen leimatun ligandin kanssa, eikä voi hiljentää signaalia, vaan mitataan korkea aikaerotteinen luminesenssi.
Tulokseksi saatiin, että leusiinivetoketjun muodostama kolmiulotteinen rakenne ei haittaa proteiinin jälkitranslaation modifikaatioiden detektointia. Pitkillä peptideillä todettiin olevan suuri sitoutumisaffiniteetti, jolloin saatiin liian matala signaalin ja taustan suhde. Affiniteetin alentamiseksi peptidejä tulisi muokata lyhyemmiksi ja vähemmän varautuneiksi. SIRT1-entsyymin konsentraatio deasetylaatiossa oli liian matala ja konsentraatiota tulisi nostaa.