Optimaalisen mittauslaitteen määrittäminen Quant-iT dsDNA, High sensitivity -kitille
Aittola, Aki (2017)
Avaa tiedosto
Lataukset:
Aittola, Aki
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201702041979
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201702041979
Tiivistelmä
Opinnäytetyö suoritettiin Thermo Fisher Scientificille, ja sen tarkoituksena oli selvittää Quant-It dsDNA High Sensitivity -kitille optimaalinen laite, kun analysoidaan pieniä DNA-pitoisuuksia. Valittua laitetta on jatkossa tarkoitus suositella kyseisen kitin käyttöön. Optimaalinen laite valittiin määrittämällä eri laitteille DNA:n toteamis- ja määritysrajat käyttämällä kitin reagensseja. Testatut laitteet olivat Varioskan LUX, Fluoroskan ja Qubit™ 3.0 Fluorometri.
Mittauksissa käytetty kitti perustuu DNA-molekyyliin sitoutumiseen fluoresoivaan fluorokromiin. Kaikki laitteet mittaavat fluoresenssisignaalia, joita verrattiin kitin mukana tulleiden kalibrointiliuosten tunnettuihin DNA-konsentraatioihin. Kalibrointisuorat olivat kaikki melko lineaarisia, mutta jokaisella laitteella suurimman kalibrointipisteen rinnakkaismääritysten hajonta oli melko suurta.
Toteamis- ja määritysrajat määritettiin analysoimalla ”blank”-näytteitä kitin mukana tulleiden kalibrointiliuosten avulla. ”Blank”-näytteinä käytettiin sekä kitin puskuriliuosta, että kitin ensimmäistä kalibrointiliuosta, jonka konsentraatioksi ilmoitettiin 0 ng/µl. Kaikkia liuoksia pipetoitiin mustalle ja valkoiselle, 96- ja 384-kaivoiselle mikrokuoppalevylle, jotta voitiin määrittää myös paras mikrokuoppalevy kitin käyttöä varten. Qubit-laitteella näytteet analysoitiin sitä varten tarkoitetuissa Qubit-putkissa.
Lisäksi tehtiin saantokoenäytteitä pienillä pitoisuuksilla. Niillä pyrittiin varmistamaan määritettyjä toteamis- ja määritysrajoja, etenkin koska ne olivat hyvin pieniä verrattuna kitin standardinäytteiden pitoisuuksiin.
Tulosten perusteella paras laite kitin käyttöön on Varioskan LUX, jonka kanssa käytetään mustaa 96-kaivoista mikrokuoppalevyä. Tällä yhdistelmällä saatiin paras toteamis- ja määritysraja, sekä parhaat saantoprosentit.
Mittauksissa käytetty kitti perustuu DNA-molekyyliin sitoutumiseen fluoresoivaan fluorokromiin. Kaikki laitteet mittaavat fluoresenssisignaalia, joita verrattiin kitin mukana tulleiden kalibrointiliuosten tunnettuihin DNA-konsentraatioihin. Kalibrointisuorat olivat kaikki melko lineaarisia, mutta jokaisella laitteella suurimman kalibrointipisteen rinnakkaismääritysten hajonta oli melko suurta.
Toteamis- ja määritysrajat määritettiin analysoimalla ”blank”-näytteitä kitin mukana tulleiden kalibrointiliuosten avulla. ”Blank”-näytteinä käytettiin sekä kitin puskuriliuosta, että kitin ensimmäistä kalibrointiliuosta, jonka konsentraatioksi ilmoitettiin 0 ng/µl. Kaikkia liuoksia pipetoitiin mustalle ja valkoiselle, 96- ja 384-kaivoiselle mikrokuoppalevylle, jotta voitiin määrittää myös paras mikrokuoppalevy kitin käyttöä varten. Qubit-laitteella näytteet analysoitiin sitä varten tarkoitetuissa Qubit-putkissa.
Lisäksi tehtiin saantokoenäytteitä pienillä pitoisuuksilla. Niillä pyrittiin varmistamaan määritettyjä toteamis- ja määritysrajoja, etenkin koska ne olivat hyvin pieniä verrattuna kitin standardinäytteiden pitoisuuksiin.
Tulosten perusteella paras laite kitin käyttöön on Varioskan LUX, jonka kanssa käytetään mustaa 96-kaivoista mikrokuoppalevyä. Tällä yhdistelmällä saatiin paras toteamis- ja määritysraja, sekä parhaat saantoprosentit.