Noroviruksen analysointi Droplet Digital PCR -laitteella ja inhibition vaikutuksen vertaaminen Droplet Digital PCR:n ja reaaliaikaisen PCR:n välillä norovirusanalyysissä
Iivanainen, Tiina (2016)
Iivanainen, Tiina
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016112316879
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016112316879
Tiivistelmä
Opinnäytetyössä testattiin norovirusanalyysin toimivuutta uudenlaisella Droplet Digital PCR -laitteella (ddPCR), joka soveltuu nukleiinihappojen kvantitatiiviseen määritykseen. Analyysin toimivuutta testattiin noroviruksen genoryhmillä GI ja GII. Työn tavoitteena oli selvittää, toimiiko analyysi riittävän hyvin ddPCR-laitteella vai onko menetelmää optimoitava ja kuinka herkkä ddPCR-menetelmä on ennestään käytössä olleeseen reaaliaikaiseen PCR-menetelmään (qPCR) verrattuna. Lisäksi työssä tutkittiin, onko näytematriisin aiheuttamalla inhibitiolla vähemmän vaikutusta ddPCR-analyysiin kuin qPCR-analyysiin.
Analyysin toimivuutta ddPCR-laitteella testattiin analysoimalla noroviruksen genoryhmien GI ja GII RNA- ja DNA-näytteitä. ddPCR-analyysi suunniteltiin käytössä olleiden noroviruksen qPCR-analyysien pohjalta. ddPCR-menetelmän herkkyyttä ja inhibition vaikutusta tuloksiin arvioitiin analysoimalla samoja näytteitä ddPCR:llä ja qPCR:llä sekä vertaamalla ddPCR-tuloksia aiemmin samoista näytteistä mitattuihin qPCR-tuloksiin.
Tulosten perusteella ddPCR-analyysi toimi hyvin noroviruksen genoryhmällä GII. Menetelmän herkkyys oli dsDNA-laimennossarjan perusteella arvioituna yhtä hyvä kuin qPCR:llä. Menetelmä toimi myös genoryhmällä GI, mutta suhteellinen herkkyys qPCR:ään verrattuna oli 88 %, eikä ddPCR:llä saatu positiivista tulosta yhtä heikosta dsDNA-laimennoksesta kuin qPCR:llä, joten GI-analyysin optimointi todettiin tarpeelliseksi.
PCR-inhibiittoreilla havaittiin olevan vähemmän vaikutusta ddPCR:llä kuin qPCR:llä määritettyyn NoV GII -pitoisuuteen eli ddPCR oli vähemmän herkkä näytematriisin aiheuttamalle inhibitiolle kuin qPCR, mikä oli odotettua muilla viruksilla aiemmin tehtyjen tutkimusten perusteella.
Noroviruksen analysoinnista ddPCR-laitteella ei ollut ennestään juurikaan tietoa. Työssä saatiin selvitettyä, että ddPCR:ää voidaan tarvittaessa käyttää qPCR:n sijaan ainakin noroviruksen genoryhmän GII analysoinnissa ja että menetelmä toimii myös genoryhmällä GI, mutta halutun herkkyyden saavuttamiseksi NoV GI -menetelmää on syytä optimoida. ddPCR:ää voidaan hyödyntää jatkossa esimerkiksi inhibitorisia näytematriiseja tutkittaessa tai noroviruksen ja referenssimateriaalien kvantitatiivisessa määrityksessä.
Analyysin toimivuutta ddPCR-laitteella testattiin analysoimalla noroviruksen genoryhmien GI ja GII RNA- ja DNA-näytteitä. ddPCR-analyysi suunniteltiin käytössä olleiden noroviruksen qPCR-analyysien pohjalta. ddPCR-menetelmän herkkyyttä ja inhibition vaikutusta tuloksiin arvioitiin analysoimalla samoja näytteitä ddPCR:llä ja qPCR:llä sekä vertaamalla ddPCR-tuloksia aiemmin samoista näytteistä mitattuihin qPCR-tuloksiin.
Tulosten perusteella ddPCR-analyysi toimi hyvin noroviruksen genoryhmällä GII. Menetelmän herkkyys oli dsDNA-laimennossarjan perusteella arvioituna yhtä hyvä kuin qPCR:llä. Menetelmä toimi myös genoryhmällä GI, mutta suhteellinen herkkyys qPCR:ään verrattuna oli 88 %, eikä ddPCR:llä saatu positiivista tulosta yhtä heikosta dsDNA-laimennoksesta kuin qPCR:llä, joten GI-analyysin optimointi todettiin tarpeelliseksi.
PCR-inhibiittoreilla havaittiin olevan vähemmän vaikutusta ddPCR:llä kuin qPCR:llä määritettyyn NoV GII -pitoisuuteen eli ddPCR oli vähemmän herkkä näytematriisin aiheuttamalle inhibitiolle kuin qPCR, mikä oli odotettua muilla viruksilla aiemmin tehtyjen tutkimusten perusteella.
Noroviruksen analysoinnista ddPCR-laitteella ei ollut ennestään juurikaan tietoa. Työssä saatiin selvitettyä, että ddPCR:ää voidaan tarvittaessa käyttää qPCR:n sijaan ainakin noroviruksen genoryhmän GII analysoinnissa ja että menetelmä toimii myös genoryhmällä GI, mutta halutun herkkyyden saavuttamiseksi NoV GI -menetelmää on syytä optimoida. ddPCR:ää voidaan hyödyntää jatkossa esimerkiksi inhibitorisia näytematriiseja tutkittaessa tai noroviruksen ja referenssimateriaalien kvantitatiivisessa määrityksessä.