ELISA-menetelmän suunnittelu ja toteutus angiopoietiinityyppisen proteiini 4:n (Angptl-4) määrittämiseksi ihmisen verestä
Heiskanen, Noora (2008)
Heiskanen, Noora
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2008
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200811133987
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200811133987
Tiivistelmä
Tämä insinöörityö tehtiin Kansanterveyslaitoksen (KTL) molekyylilääketieteen osastolla, sydän- ja verisuonitauteja sekä niiden aineenvaihduntaa tutkivassa ryhmässä. Rasva-aineenvaihduntaan osallistuu lukuisia välittäjäaineita sekä signaalimolekyylejä, jotka vaikuttavat paikallisesti sekä kulkeutumalla veren mukana elimistön muihin osiin. Tässä työssä keskityttiin tutkimaan yhtä rasvakudoksen signaalimolekyyliä, Angiopoietiinityyppistä proteiini 4:ää (Angptl-4), jonka on todettu olevan suoraan yhteydessä rasvakudoksen laatuun ja määrään sekä plasman rasva-aineiden tasoon.
Työssä suunniteltiin ELISA-testi ihmisen Angptl-4-tason mittaamiseen seerumista. Työn lähtökohtana oli kahden Angptl-4-proteiinin peptidin injektointi neljään kaniin vasta-aineen tuottamiseksi kanin seerumissa. Tuotettu IgG-vasta-aine puhdistettiin kaniseerumista korkean resoluution nestekromatografialla (HPLC). Saatujen vasta-aineiden puhtaus testattiin SDS-PAGE-menetelmällä ja IgG-vasta-aineiden sitoutumista tutkittiin Western Blot -menetelmällä. Lisäksi osalle IgG-vasta-aineista tehtiin entsyymileimaus piparjuuriperoksidaasilla, jotta niitä voitiin käyttää ELISA-testissä sekundaarisena vasta-aineena.
Lopullinen Angptl-4-pitoisuus seerumissa määritettiin vertaamalla paastottua ihmisen seerumia paastotuista hiiriadiposyyteistä mitattuun totaaliproteiinipitoisuuteen. ELISA-testissä todettiin IgG-vasta-aineiden sitoutuvan ihmisen paastotun seerumin Angptl-4:ään, jonka lisäksi Angptl-4:n todettiin ilmenevän solujen kasvuliuoksessa. Saaduista tuloksista pääteltiin ELISA-testin toimivan hyvin, mutta riittävien toistomittausten suorittaminen jäi tekemättä. Angptl-4:n mittaamiseksi rutiininomaisesti seerumista täytyisi menetelmä kehittää kokonaiselle Angptl-4-proteiinille käytettyjen peptidipätkien sijasta.
Työssä suunniteltiin ELISA-testi ihmisen Angptl-4-tason mittaamiseen seerumista. Työn lähtökohtana oli kahden Angptl-4-proteiinin peptidin injektointi neljään kaniin vasta-aineen tuottamiseksi kanin seerumissa. Tuotettu IgG-vasta-aine puhdistettiin kaniseerumista korkean resoluution nestekromatografialla (HPLC). Saatujen vasta-aineiden puhtaus testattiin SDS-PAGE-menetelmällä ja IgG-vasta-aineiden sitoutumista tutkittiin Western Blot -menetelmällä. Lisäksi osalle IgG-vasta-aineista tehtiin entsyymileimaus piparjuuriperoksidaasilla, jotta niitä voitiin käyttää ELISA-testissä sekundaarisena vasta-aineena.
Lopullinen Angptl-4-pitoisuus seerumissa määritettiin vertaamalla paastottua ihmisen seerumia paastotuista hiiriadiposyyteistä mitattuun totaaliproteiinipitoisuuteen. ELISA-testissä todettiin IgG-vasta-aineiden sitoutuvan ihmisen paastotun seerumin Angptl-4:ään, jonka lisäksi Angptl-4:n todettiin ilmenevän solujen kasvuliuoksessa. Saaduista tuloksista pääteltiin ELISA-testin toimivan hyvin, mutta riittävien toistomittausten suorittaminen jäi tekemättä. Angptl-4:n mittaamiseksi rutiininomaisesti seerumista täytyisi menetelmä kehittää kokonaiselle Angptl-4-proteiinille käytettyjen peptidipätkien sijasta.